Finalmente, tras cuatro décadas de relativa calma para la Iglesia, comienza el dolor de nuevo por medio de la gran persecución de Diocleciano que se desarrollaría con distinta intensidad en la Tetrarquía que él había establecido para mejor gobernar el Imperio.
La prueba comienza con un edicto del 23 de febrero de 303, que ordenaba la destrucción de todas las iglesias, exigía que todos los libros sagrados fueran entregados y quemados, se prohibían las reuniones litúrgicas, y se privaba de los derechos civiles a los cristianos. Era el primer edicto de un total de cuatro que se irían promulgando. Éste insistiría en que los funcionarios cristianos fuesen despedidos, los cortesanos imperiales fuesen degradados públicamente.
El segundo edicto llegaría dos meses más tarde, en abril, por culpa de unos disturbios en Siria y Mitilene que se les achacaron a los cristianos, además de provocar el incendio del palacio imperial. Por ello, muchos cristianos fueron cruelmente torturados y ejecutados. Los sacerdotes y diáconos de Nicomedia, ciudad donde residía el emperador, fueron ajusticiados junto con su obispo Antimo. Otros sacerdotes fueron encarcelados para privar a los fieles de sus pastores.
Un tercer edicto exigía a los clérigos encarcelados que ofreciesen sacrificios a los dioses. Los que se negasen serían ejecutados. La persecución se extendió a todos los clérigos del Imperio.
En la primavera de 304 se promulgó el último edicto que contenía la orden precisa que obligaba a todos los habitantes del Imperio a ofrecer sacrificios a los dioses y extendió el terror de la persecución entre la población cristiana.